कार्सिनोजेनेसिस और उत्परिवर्तन जर्नल

अमूर्त

डीएनए स्ट्रैंड ब्रेक एसोसिएटेड बाईस्टैंडर इफेक्ट (डीएसबी-एबीई) को मापने के लिए ई18 सेल मॉडल का उपयोग

जलाल नासिर

लिम्फोब्लास्ट सेल लाइन E18 TK6 का व्युत्पन्न है और विषमयुग्मी TK1 / tk1 जीन के इंट्रॉन 2 में I-Sce1 डाला गया है। विकिरण स्वतंत्र डीएनए क्षति और संबंधित बाईस्टैंडर प्रभाव को मापने के लिए I-Sce1 साइट पर डबल स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करने के लिए I-Sce1 प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज के साथ E18 को लक्षित किया जा सकता है। E18 सेल लाइन के निर्माण के लिए एक Eco47III साइट को pTK-UAS रैखिक प्लास्मिड बैकबोन में डाला गया और DNA लाइगेज की उपस्थिति में ISce1 प्रतिबंध अनुक्रम के ब्लंट-एंडेड ऑलिगोन्युक्लियोटाइड्स के साथ एनील किया गया। DH5-α कोशिकाओं को pTK-UAS-Eco47III-Sce1 के साथ कोशिकाओं को गर्म करके और एम्पीसिलीन प्रतिरोधी कॉलोनियों का चयन करके रूपांतरित किया गया। प्लास्मिड डीएनए को निकाला गया और Eco47III और I-Sce1 साइटों की उपस्थिति के लिए उसका विश्लेषण किया गया। थाइमिडीन काइनेज सक्रिय एलील के इंट्रॉन 2 में I-Sce साइट वाले एक क्लोन को आगे के प्रयोग के लिए चुना गया और इसका नाम E18 रखा गया। इस मॉडल का परीक्षण डबल स्ट्रैंड ब्रेक प्रेरित उत्परिवर्तनों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था और ये स्ट्रैंड ब्रेक डीएनए स्ट्रैंड ब्रेक से जुड़े बाईस्टैंडर प्रभाव (DSB-ABE) का उत्पादन भी कर सकते हैं, जैसा कि नैवे कोशिकाओं में उत्परिवर्तन आवृत्ति में वृद्धि द्वारा मापा जाता है। GFP मार्कर ले जाने वाले प्लास्मिड pAdTrackCMV I-Sce1 को I-Sce1 प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज को व्यक्त करने के लिए E18 कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था जो विशेष रूप से सक्रिय TK एलील के इंट्रॉन 2 पर I-Sce1 साइट को लक्षित करता है। डीएनए क्षति को प्रेरित करने और DMF और BMF को परिमाणित करने के लिए pAdTrackCMV I-Sce1 के माध्यम से एक बहिर्जात I-Sce1 अभिव्यक्ति के साथ E18 को लक्षित करने के अंतिम बिंदु के रूप में बाईस्टैंडर उत्परिवर्तन अंश (BMF) को मापने के लिए प्रत्यक्ष उत्परिवर्तन अंश (DMF) को मापने के लिए उत्परिवर्तन अंश परख का उपयोग किया गया था या नैवे कोशिकाओं में वातानुकूलित माध्यम स्थानांतरण के साथ।