पोषण संबंधी विकार और थेरेपी जर्नल

अमूर्त

क्लिनिकल न्यूट्रिशन 2019: चूहों में आंतों की अखंडता पर कोम्बुचा चाय के प्रभाव- एलाहेह महमूदी- अल्बोरज़ यूनिवर्सिटी ऑफ़ मेडिकल साइंसेज

इलाहेह महमूदी

उद्देश्य: ऑक्सीडेटिव तनाव हाइपरपीसिया के रोगजनन में शामिल है, जो हृदय संबंधी रुग्णता और मृत्यु दर के लिए एक जोखिम कारक है। कई मानव अध्ययनों से पता चला है कि टमाटर कैरोटीनॉयड मानव स्वास्थ्य के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रस्तुति के दौरान लेखक दो मुद्दों को संबोधित करेंगे ??? a) यूवी विकिरण के लिए त्वचा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को संतुलित करना और b) ऊंचा महत्वपूर्ण संकेत की कमी। a) कई मानव अध्ययनों से पता चला है कि टमाटर कैरोटीनॉयड एरिथेमा को कम करके और कोलेजन उत्पादन और टूटने के बीच संतुलन में सुधार करके यूवी-प्रेरित क्षति को कम कर सकते हैं। हमने परिकल्पना की कि पॉलीफेनोल के साथ टमाटर कैरोटीनॉयड का मिश्रण उनकी गतिविधि के योग से अपेक्षित बेहतर त्वचा सुरक्षा प्रदान कर सकता है। वास्तव में, हमने समझा कि टमाटर पोषक तत्व कॉम्प्लेक्स (जिसमें लाइकोपीन होता है) और रोज़मेरी अर्क (जिसमें पॉलीफेनॉल कार्नोसिक एसिड होता है) का मिश्रण सहक्रियात्मक रूप से सूजन के मार्करों को कम करता है और त्वचा कोशिकाओं में एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को प्रेरित करता है, जो मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (एमएमपी) को कम करता है और इस प्रकार कोलेजन टूटने को कम कर सकता है और त्वचा की उम्र बढ़ने में देरी कर सकता है। बी) हाइपरपीसिया हृदय संबंधी रुग्णता और मृत्यु दर के लिए एक जोखिम कारक हो सकता है। हमने उच्च रक्तचाप वाले व्यक्तियों के बीच सामान्य संकेत बनाए रखने में टमाटर पोषक तत्व कॉम्प्लेक्स पूरक की इष्टतम प्रभावी खुराक को उजागर करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया विश्लेषण किया। सामग्री और तरीके:

छलनी जैसी आंत को सात दिनों तक पेय में डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट का उपयोग करके युवा और वयस्क के दो समूहों में प्रेरित किया गया। पहले, एफकेटी को कोलाइटिस से पीड़ित चूहों में प्रबंधित किया गया था और कोलाइटिस से पीड़ित आयु-समरूप सामान्य और अनुपचारित जानवरों से संबंधित था।

कोम्बुचा चाय (केटी) की तैयारी

काली चाय (गोलेस्तान, तेहरान, ईरान) को उबलते पानी (1.2% w/v) में मिलाया गया, मिलाया गया और 10 मिनट के लिए पकने के लिए छोड़ दिया गया। फिर चाय को एक बाँझ छलनी के माध्यम से फ़िल्टर किया गया, और सुक्रोज (10%) को चाय में घोल दिया गया। KT को व्यवस्थित करने के लिए, ठंडी चाय के 200 मिलीलीटर को 3% w/v चाय कवक और 10% v/v KT तरल के साथ टीका लगाया गया था जो पहले से किण्वित था। फिर एकत्रीकरण को 14 दिनों के लिए 28 °C पर ऊष्मायन करके किण्वन के लिए छोड़ दिया गया। फ़िल्टर्ड KT (fKT) बनाने के लिए, परिणामी किण्वित चाय को 20 मिनट के लिए 5000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और एक एयर पंप से लैस 0.45 µm सेल्यूलोज फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया।

प्रायोगिक समूह और अध्ययन डिजाइन

Male NMR mice were purchased from the Pasteur Institute Experimental Animal Center, Tehran, Iran. All animals were housed for one week before the experiments began in light- and temperature-regulated rooms at the traditional animal department of Alborz University of Medical Sciences.  All experimentations were permitted by the native ethical group (reference No Abzums.Rec.1395.51) and performed consistent with Animal Care and Use Protocol of Alborz University of Medical Sciences.

The animals were divided into two groups of young and old. Each group was then further subdivided into two groups (8 in each) including normal and colitis-induced. because the figure indicates, each of colitis-induced old or young groups was further subdivided into two subgroups, including colitis-induced with no treatment and colitis-induced treated with fKT. The study was performed in three phases. within the initiative , DSS-induced colitis was found out in young (2 months) and old (16 months) mice during a period of 21 days during which weight loss and therefore the clinical score were evaluated and compared with the age-matched healthy animals. within the second phase, the effect of fKT administration on survival analysis and therefore the clinical score were evaluated during a period of 21 days. After completion of phase I clinical trial and II of the study, molecular and histological evaluations were performed on young and old healthy controls, DSS-induced colitis, and DSS-induced colitis treated with fKT animals in phase III clinical trial . Considering the deathrate and clinical signs that occurred within the animals with colitis, animals at this phase of the study were sacrificed on day 14 after the start of the study.

Colitis induction

Colitis was induced on day 0 using administration of drinking water containing 3.5% (w/v) dextran sodium sulfate salt (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Germany) per mouse per day. The animals and clinical signs of disease were daily monitored, indicated by weight loss, occurrence of blood in the stool or around the rectum, and diarrhea until day seven after the colitis induction. Weight loss was determined by comparing the body weight for each mouse to the baseline body weight and expressed as a percentage of weight loss. Other symptoms were scored according to the previously suggested system by Siegmund et al. Briefly, the different signs for stool consistency were scored as follows: score 0, well-formed pellets; score 2, pasty and semi-formed stools that did not adhere to the anus; score 4, liquid stools that did adhere to the anus. The different signs for bleeding were scored as follows: score 0, no blood measured using the Hemoccult system (Beckman Coulter); score 2, positive Hemoccult; score 4, gross bleeding. Animals with borderline scores were given a one-half score.

Histological and histopathological analysis

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

चूहों में डीएसएस-प्रेरित कोलाइटिस कोलाइटिस के रोगजनन से निपटने और उपचारात्मक दृष्टिकोणों का आकलन करने के लिए सामान्य पशु मॉडल है। यह मॉडल हमारी प्रयोगशाला में खोजा गया था और 21 दिनों की अवधि (चरण I) के लिए निगरानी की गई थी। ऐसा करने के लिए, नर एनएमआर चूहों को सात दिनों के लिए पेय में 3.5% डीएसएस दिया गया था। जीवित रहने की दर, वजन घटाने और रक्तस्राव और दस्त सहित कोलाइटिस के नैदानिक ​​​​लक्षणों के लिए अध्ययन की अवधि के दौरान जानवरों की दैनिक जांच की गई और उम्र के अनुरूप स्वस्थ जानवरों के साथ तुलना की गई। युवा DSS-उपचारित जानवरों के उत्तरजीविता विश्लेषण से पता चला है कि 66% और 33% जानवर क्रमशः 7 और 14 दिन को जीवित थे, और सभी 2 दिन पर मर गए थे। सिर्फ पुराने DSS-उपचारित जानवरों के मामले में, उत्तरजीविता विश्लेषण से पता चला है कि 66% और 50% जानवर क्रमशः 7 और 14 दिन को जीवित थे, और सभी 21 दिन पर मर गए थे। आयु-समरूप स्वस्थ जानवरों की तुलना में DSS-उपचारित युवा और वृद्ध समूहों में वजन में बड़ी कमी आई थी। DSS-उपचारित युवा चूहों ने क्रमशः 7 और 14 दिन पर अपने वजन का लगभग 10% और 46% खो दिया था। DSS-उपचारित वृद्ध चूहों ने क्रमशः 7 और 14 दिन पर अपने वजन का लगभग 13.5% और 15% खो दिया था। ये परिणाम दर्शाते हैं कि डीएसएस-उपचारित युवा चूहों में डीएसएस-उपचारित वृद्ध चूहों की तुलना में अधिक गंभीर नैदानिक ​​लक्षण और कम जीवित रहने की दर दिखाई देती है।

ऊतकवैज्ञानिक अवलोकन

सभी DSS-चुनौती वाले युवा और वृद्ध चूहों के H&E-रंजित ऊतक खंडों (चित्र 6) के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण ने आयु-समरूप स्वस्थ चूहों की तुलना में PMNs, क्रिप्टिक हानि, उपकला दोष, म्यूकोसल विघटन, एपोप्टोसिस, एडिमा और म्यूकोसल पतलेपन की घुसपैठ में वृद्धि दिखाई। fKT के साथ उपचार ने चोट की सीमा को कम कर दिया, हालांकि इस अध्ययन के दौरान प्रशासित आहार द्वारा स्वस्थ स्थिति में पूरी तरह से उलटफेर नहीं हुआ। उल्लेखनीय रूप से, वृद्ध स्वस्थ चूहों में युवा, स्वस्थ जानवरों की तुलना में PMNs, क्रिप्टिक हानि और एडिमा की घुसपैठ अधिक थी। जैसा कि चित्र 6c में दर्शाया गया है, DSS प्रशासन द्वारा म्यूकोसल की मोटाई कम हो गई क्योंकि DSS-प्रेरित कोलाइटिस वाले युवा और वृद्ध दोनों में नैदानिक ​​स्कोर बढ़ गया। यह कार्य आंशिक रूप से बार्सिलोना, स्पेन में 04-06 मार्च, 2019 को आयोजित क्लिनिकल पोषण पर 24 ^वें  अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन में प्रस्तुत किया गया है ।