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जैव प्रौद्योगिकी कांग्रेस 2015: फीड-बैच प्रक्रियाओं में रासायनिक रूप से संशोधित सिस्टीन और CHO विशिष्ट उत्पादकता पर प्रभाव - एलाइन ज़िमर मर्क मिलिपोर

एलाइन ज़िमर

स्तनधारी कोशिकाओं की औद्योगिक फीड-बैच खेती का उपयोग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसे चिकित्सीय प्रोटीन के उत्पादन के लिए किया जाता है। प्रारंभिक वृद्धि सुनिश्चित करने वाले माध्यम के अलावा, विकास, व्यवहार्यता और एंटीबॉडी उत्पादन में सुधार के लिए फीडिंग आवश्यक है। स्थापित वाणिज्यिक प्रणालियों में एक हल्का अम्लीय केंद्रित मुख्य फ़ीड और एल-टायरोसिन और एल-सिस्टीन युक्त एक अलग क्षारीय अमीनो एसिड फ़ीड शामिल है। चूंकि एल-सिस्टीन हवा और धातु उत्प्रेरक की उपस्थिति में सिस्टीन में इसके द्विगुणन के कारण स्थिर नहीं है, इसलिए तटस्थ पीएच फ़ीड में सभी अमीनो एसिड को शामिल करने के लिए एक स्थिर एल-सिस्टीन व्युत्पन्न की आवश्यकता होती है। फीडिंग योजनाओं को सरल बनाने और पीएच और डीओ संकेतों दोनों के स्थिरीकरण के माध्यम से समग्र प्रक्रिया मजबूती में सुधार करने के लिए उन एकल फ़ीड प्रणालियों का पक्ष लिया जाता है। यहां, हम एक औद्योगिक एकल फ़ीड फ़ेड-बैच प्रक्रिया में फॉस्फोर टायरोसिन डिसोडियम नमक के साथ संयोजन में रासायनिक रूप से संशोधित सिस्टीन के उपयोग का सुझाव देते हैं जो छोटे पैमाने पर और साथ ही बायोरिएक्टर में लागू होता है। सेल कल्चर प्रयोग या तो स्पिन ट्यूब या बायोरिएक्टर में CHO सस्पेंशन सेल लाइन के साथ किए गए, जो मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को व्यक्त करता है। व्यवहार्य सेल घनत्व और व्यवहार्यता को एक स्वचालित सेल काउंटिंग डिवाइस का उपयोग करके मापा गया। प्री-कॉलम डेरिवेटिवाइजेशन और UPLC विश्लेषण के बाद अमीनो एसिड के लिए और LC-MS/MS का उपयोग करके विटामिन के लिए सुपरनैटेंट्स का खर्च किया गया मीडिया विश्लेषण किया गया।

फोटोमेट्रिक और टर्बिडोमेट्रिक विधियों पर निर्भर करते हुए सेडेक्स बायो एचटी के साथ मेटाबोलाइट माप किए गए। ग्लाइकेन विश्लेषण के लिए 2-एबी लेबलिंग, चार्ज वेरिएंट विश्लेषण के लिए सीआईईएफ और पेप्टाइड मैपिंग प्रयोगों के लिए एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का लक्षण वर्णन किया गया। संशोधित सिस्टीन व्युत्पन्न युक्त फ़ीड के स्थिरता अध्ययनों से पता चला कि अणु स्थिर था और कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर तीन महीनों में कोई एल-सिस्टीन या एल-सिस्टीन जारी नहीं किया गया था। इसके अलावा, समय के साथ फ़ीड के रंग में कोई बदलाव नहीं देखा गया। छोटे पैमाने के बैच प्रयोग जहां एल-सिस्टीन को रासायनिक रूप से संशोधित सिस्टीन की समान मात्रा से बदल दिया गया था, ने विकास या व्यवहार्यता प्रोफाइल में कोई बदलाव नहीं दिखाया। छोटे पैमाने पर खिलाए गए बैच प्रक्रियाओं में संशोधित सिस्टीन व्युत्पन्न के उपयोग ने स्थापित दो फ़ीड सिस्टम की तुलना में तुलनीय अधिकतम व्यवहार्य कोशिका घनत्व, लंबे समय तक व्यवहार्यता और बढ़े हुए टिटर का संकेत दिया।

बायोरिएक्टर प्रयोगों ने छोटे पैमाने पर वर्णित विशिष्ट उत्पादकता में वृद्धि की पुष्टि की जब एकल फ़ीड रणनीति की तुलना दो फ़ीड रणनीति से की गई। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के गहन लक्षण वर्णन ने ग्लाइकोसिलेशन या चार्ज वैरिएंट पैटर्न में कोई बदलाव नहीं दिखाया जबकि पेप्टाइड मैपिंग प्रयोग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के अनुक्रम में संशोधित अमीनो एसिड के किसी भी एकीकरण का पता लगाने में सक्षम नहीं थे। मोनोक्लोनल न्यूट्रलाइज़र (mAb) निर्माण के लिए स्तनधारी देखभाल वाले क्लंप फॉर्म कुछ सप्लीमेंट्स जैसे कि ग्लूकोज, पोषक तत्व और अमीनो एसिड की महत्वपूर्ण देखभाल पर निर्भर करते हैं ताकि कल्चर समय का विस्तार किया जा सके और प्रोटीन उत्पादन में सुधार हो सके [1]। वास्तविक प्रक्रियाओं में, एल-सिस्टीन और एल-टायरोसिन को घुलनशील पीएच पर स्वतंत्र रूप से संभाला जाता है क्योंकि तटस्थ पीएच पर उनकी कम स्थिरता और कम घुलनशीलता होती है, जिससे पीएच टॉप और अवक्षेपण होता है [2]। अत्याधुनिक रूपों को बेहतर बनाने के लिए, दोनों अमीनो एसिड को उनकी विशेष ठोसता और घुलनशीलता प्रोफाइल को बेहतर बनाने के लिए कृत्रिम रूप से बदल दिया गया है। पिछले शोध से पता चला है कि फॉस्फोटायरोसिन डिसोडियम साल्ट (PTyr2Na) एक स्थिर एल-टायरोसिन सब्सिटेंट है और इसका उपयोग जीवनशैली निष्पादन या mAb गुणवत्ता विशेषताओं को प्रभावित किए बिना तटस्थ pH देखभाल में किया जा सकता है[3]। यहाँ, हम एक तटस्थ pH, सिंगल-फ़ीड ढांचे में L-सिस्टीन सब्सिटेंट का उपयोग करके प्राप्त परिणाम प्रस्तुत करते हैं।

एल-सिस्टीन सहायक की निर्भरता का मूल्यांकन तटस्थ पीएच, सेलवेंटोTM फीड-220 में कमरे के तापमान या 4°C पर एक चौथाई वर्ष के दौरान किया गया था। समूह समुदायों के लिए, एक मानव mAb संचार करने वाले CHO K1 क्लोन का उपयोग किया गया था। उत्पाद प्रक्रिया निर्देश के अनुसार सेलवेंटो™ CHO-220 मीडिया ढांचे में विकास किया गया था। नियंत्रण के लिए, सेलवेंटो™ फीड-220 और एक अलग मूल सिस्टीन/टायरोसिन फ़ीड का उपयोग किया गया था, हालांकि एकल फ़ीड प्रक्रिया में, एल-सिस्टीन सहायक और PTyr2Na को निष्पक्ष पीएच, प्राथमिक फ़ीड में वैध रूप से घुलनशील किया गया था। परीक्षण टर्न ट्यूब और 1.2L बायोरिएक्टर में किए गए थे। विकास और तर्कसंगतता को ViCell® का उपयोग करके देखा गया था, टिटर को Cedex Bio HT का उपयोग करके हल किया गया था और स्पष्ट लाभप्रदता को टिटर, महत्वपूर्ण व्यवहार्य सेल मोटाई और कमजोर पड़ने के आधार पर निर्धारित किया गया था।

खर्च किए गए मीडिया की जांच के लिए, एल-सिस्टीन सहायक और एमिनो संक्षारक माप UPLCusing AccQ·TagTMUltra अभिकर्मक द्वारा किया गया था। फ़ीड की प्रतिक्रियाशील क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, H2DCFDA को तटस्थ pH में जोड़ा गया, सेलवेंटो™ फ़ीड-220 को अधीनस्थ के साथ बढ़ाया गया या नहीं। इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के मूल्यांकन के लिए, कोशिकाओं को कार्बोक्सी-H2DCFDA के साथ चिह्नित किया गया था और प्रतिदीप्ति का अनुमान लगाया गया था। सहायक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की सीमा का आकलन करने के लिए, सेल लाइसेट्स को स्पाइक किया गया और UPLC द्वारा आकार की वस्तुओं का मूल्यांकन किया गया। mAb परीक्षा के लिए, 2-AB मार्किंग के बाद HPLC का उपयोग करके N-ग्लाइकोसिलेशन को मापा गया, जबकि चार्ज भिन्नताओं को cIEF का उपयोग करके हल किया गया।

तटस्थ पीएच फ़ीड में एल-सिस्टीन सहायक स्थिरता की जांच ने अधीनस्थ निर्धारण या एल-सिस्टीन/एल-सिस्टीन निर्वहन में कोई बदलाव नहीं दिखाया जब कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चौथाई साल से अधिक समय तक रखा गया। कोई वर्षा या रंग परिवर्तन नहीं देखा गया, यह दर्शाता है कि अधीनस्थ परीक्षण की गई स्थितियों के तहत स्थिर था। एकल-फ़ीड प्रक्रिया के साथ टर्न ट्यूबों में नियंत्रित समूह विकास ने नियंत्रण स्थिति की तुलना में उच्च अंतिम व्यवहार्यता को जन्म दिया, जिससे अंतिम टिटर में सुधार हुआ। बायोरिएक्टरों में टर्न ट्यूब परिणामों की पुष्टि की गई, जिससे एकल फ़ीड पद्धति के साथ उच्च अंतिम व्यवहार्यता, विस्तारित टिटर और उच्च स्पष्ट लाभप्रदता हुई।

H2DCFDA को निष्पक्ष pH में विस्तारित करने के बाद कम रंग ऑक्सीकरण का अनुमान लगाया गया, सेलवेंटो™ फीड-220 में अकेले फ़ीड की तुलना में अधीनस्थ कम ग्रहणशील क्षमता दिखा रहा था। कार्बोक्सी-H2DCFDA को टर्न ट्यूब सिंगल-फीड से उपचारित समूह समुदायों में विस्तारित करके कम इंट्रासेल्युलर रंग ऑक्सीकरण की पहचान की गई, जो अधीनस्थ का उपयोग करते समय कम इंट्रासेल्युलर ग्रहणशील प्रजातियों की आयु दिखा रहा था। जब सेल लाइसेट्स में स्पाइक किया गया, तो सिस्टीन अधीनस्थ का उपयोग सिस्टीन के लिए किया गया था। जारी किए गए mAb में N-ग्लाइकोसिलेशन या चार्ज भिन्नता में कोई अंतर नहीं देखा गया, जो कि पेश किए गए मूल गुणवत्ता विशेषताओं पर सहायक का कोई प्रभाव नहीं दर्शाता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि L-सिस्टीन सहायक और PTyr2Na को एक तटस्थ pH देखभाल में शामिल किया जा सकता है और इसे संभाले गए क्लस्टर रूपों में L-सिस्टीन के स्रोत के रूप में उपयोग किया जा सकता है, जिससे mAb मूल गुणवत्ता गुणों को प्रभावित किए बिना उच्च स्पष्ट दक्षता प्राप्त होती है।